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    公开号:WO1992006714A1
    申请号:PCT/JP1991/001431
    申请日:1991-10-18
    公开日:1992-04-30
    发明作者:Kazuo Akima；Yuhei Iwata；Kayoko Matsuo；Nobutoshi Watari
    申请人:Shiseido Co., Ltd.；
    IPC主号:A61K47-00
    专利说明:
    [0001] 明 糸 書
    [0002] ヒ アルロ ン酸ー薬効成分結合物質及びその製造方法 [技術分野]
    [0003] 本発明は ヒ アルロ ン酸一薬効成分結合物質及びそ の製 造方法、 特に ヒ ア ルロ ン酸の生体内特定部位への指向性 を利用 した ヒ アル口 ン酸ー薬効成分結合物質及びその製 造方法に関する。
    [0004] [背景技術 ]
    [0005] 例えば抗癌剤等の薬効成分は、 生体内において所望の 薬理作用を奏する と共に、 生体に対する副作用が極めて 重要であ る。
    [0006] 薬効成分の副作用の低下には、 該薬効成分自体の副作 用が低い こ とが望ま し いが、 その薬効成分を作用部位に のみ指向さ せる こ とを可能とすれば、 他の組織への副作 用は非常に少な く てすむ。
    [0007] 最近、 こ の よ う な考え方に越づき、 いわゆ る ドラ ッ グ デ リ バ リ ー シス テムの開発が進んでお り 、 抗癌剤等一般 に副作用の強い薬剂の投与には欠かせな い技術と な り つ つあ る。
    [0008] と こ ろが、 生体内における一般的な ドラ ッ グデ リ ノ リ — シス テム にあ っ ては、 基本的には体循環血液に依存 し あ るいは影響を受け、 全身への影響を防止する のは極め て困難であ っ た。
    [0009] こ のため、 極めて効粜的な薬効を有 し なが ら、 他の組 織への副作用を考慮 しな ければな らないため、 薬剤の的 確な投与が難 しい状況にあ っ た。
    [0010] 一方、 従来の薬効成分では特定の患部組織、 特に癌組 織等に対する指向性が低く 、 充分な薬効を得るためには 多量の薬効成分投与が要求されていた。
    [0011] そ こ で、 従来において もデキス ト ラ ン、 ア ルブ ミ ン等 の各種高分子物質と薬効成分を結合さ せ、 その高分子物 質の体内組織指向性及び薬効成分の徐放性を利用 して副 作用の低減あ る いは薬効の向上を図ってい る例があ る。
    [0012] しか し、 従来用い られる高分子物質の殆どは生体、 特 に人体由来ではな く 、 人体に適用 した場合、 その分解、 代謝に際 して人体に与える負担が大き い と い う課題があ つ †：。
    [0013] ま た、 デキス ト ラ ン等を用いた場合に も、 縮合反応時 に高分子物質の構造に変化が生 じて し ま い、 やは り 人体 内には存在 しない物質とな っ て し ま う こ とが多かっ た。
    [0014] [発明の開示 ]
    [0015] 本発明は前記従来技術の課題に鑑みな された も のであ り 、 他組織への影響を低く 抑えつつ、 効率的な薬効の発 揮を可能とする薬効成分結合物質を提供する こ と にあ る。
    [0016] 前記目的を達成する ために本発明者 らが鋭意検討 した 結果、 人体内に普遍的に存在する ヒ アル ロ ン酸に薬効成 分を結合さ せる こ と によ り 、 生体内において特定部位へ の指向性の高い薬効成分結合物質が得 られる こ とを見出 し本発明を完成する にいた っ た。
    [0017] すなわち本出願の請求 ¾ 1 記載の ヒ ア ルロ ン酸ー薬効 成分結合物質は、 ヒ ア ル ロ ン酸と薬効成分を共有結合さ せた こ とを特徴とする。
    [0018] 請求項 2 記載の ヒ ア ル ロ ン酸一薬効成分結合物質は、 ヒ アルロ ン酸のダルク 口 ン酸残基のカ ルボキ シル基に薬 効成分がア ミ ド結合されてい る こ とを特徴とする。
    [0019] 請求項 3 記載の癌の リ ンパ節転移抑制剤は、 ヒ ア ルロ ン酸ー薬効成分結合物質において、 薬効成分が抗癌剤で あ る こ とを特徴とする。
    [0020] 請求項 4 記載の非特異的癌 ミ サイ ル療法剤は、 ヒ アル ロ ン酸一薬効成分結合物質において、 薬効成分は抗癌剤 であ る こ とを特徴とする。
    [0021] 請求項 5 記載の癌の リ ンパ節転移抑制剤は、 ヒ アルロ ン酸がァセチル化 ヒ アル口 ン酸であ る こ とを特徵とする。 請求項 6 記載の非特異的 ミ サイ ル療法剤は、 ヒ アルロ ン酸がァセチル化 ヒ アル口 ン酸であ る こ と を特徴とする。 請求項 7 記載の ヒ アルロ ン酸ー薬効成分結合物質の製 造方法は、 ヒ アルロ ン酸ナ ト リ ウ ム水溶液に ピ リ ジ ン及 び塩酸を加え攪拌後、 1 —ェチル ー 3 — （ 3 — ジメ チ ル ァ ミ ノ プロ ビル） カ ルポジイ ミ ド （ E D C ) 及び N — ヒ ドロキ シ こ は く 酸イ ミ ドを加え反応させる ヒ アル ロ ン酸 活性化工程と、 活性化 ヒ ア ル ロ ン酸を リ ン 酸緩衝液に溶 解さ せ、 薬効成分水溶液を加え反応させる結合工程と、 を含むこ と を特徴とする。
    [0022] 請求項 8 記載のァセチル化 ヒ アル口 ン酸ー薬効成分結 合物質の製造方法は、 ヒ ア ルロ ン酸と してァセチル化 ヒ ア ルロ ン酸を用い、 有機溶媒系で水溶液中では行なえな い合成法によ り 薬効成分と反応さ せる こ とを特徴とする。
    [0023] 請求項 9 記載の ヒ アルロ ン酸ー薬効成分結合物質の製 造方法は、 ヒ アルロ ン酸と し てァセチル化 ヒ ア ルロ ン酸 を用い、 有機溶媒系で薬剤と結合反応さ せ、 その後、 ァ セチル基を除去する こ とを特徴とする。 なお、 本発明において薬効成分と しては、 マイ ト マィ シ ン C 、 ダウ ノ マイ シ ン、 ク ロモ ミ シ ン A 3、 ブ レオマ イ シ ン 、 ネオカ ル ジ ノ ス 夕 チ ン、 ァ ク チ ノ マ イ シ ン D、 ア ド リ アマ イ シ ン、 ミ ス ラ マ イ シ ン等の抗生物質系抗腫 瘍剤、
    [0024] ビス （ 2 — ク ロ ロェチル） ァ ミ ン （ナ イ ト ロ ジ エ ンマ ス 夕 一 ド） 誘導体、 ア ジ リ ジ ン （エチ レ ン ィ ミ ン） 誘導 体、 メ タ ン スルホ ン酸エステル誘導体、 N—ア ルキ ル一 N—二 ト ロ ソ尿素誘導体、 臭化ア ルキル誘導体、 塩酸メ ク ロ レ タ ミ ン、 ク ロ ラ ンブチノレ、 メ ルフ ァ ラ ン、 シ ク ロ フ ォ ス フ ア ミ ド、 ト リ エチ レ ン メ ラ ミ ン、 チォテパ、 ブ ス ルフ ァ ン等のア ルキル化剤系抗腫瘍剤、
    [0025] メ ノレカ プ ト ブ リ ン、 フ ノレオ ロ ウ ラ シノレ、 N — ( 2 - テ ト ラ ヒ ド ロ フ リ ル） 一 5 — フ ルォ ロ ウ ラ シ ル、 塩酸ァ ン シ タ ビ ン等の代謝拮抗物 ¾系抗腫瘍剂、
    [0026] ジェチノレス チノレべス ト ロ ー ル、 へキセス ト ー ル、 ェチ ニルエス ト ラ ディ オール、 テス ト ス テ ロ ンプ ロ ビオネ一 ト 、 フ ノレォキ シ メ ステ ロ ン、 ド ロ モス タ ノ ロ ンプロ ビネ — ト 、 プ レ ドニ ゾ ン、 プ レ ドニ ゾ ロ ン等のホ ルモ ン物質 系抗腫瘍剤、
    [0027] の外、 L —ァスパ ラ ギナーゼ、 ビ ン 力 ア ル力 ロ イ ド等カ 挙げられる。
    [0028] ヒ ア ル ロ ン酸の体内動態、 さ ら には ヒ アル ロ ン酸一薬 効成分結合物質の体内動態については、 未だそのすベて が解明 されたわけではない。
    [0029] そ こ で、 本発明者 ら は分子量 1 , O O O k d の ヒ ア ル ロ ン酸ナ ト リ ウ ム の 1 4 C標識体を用い、 ヒ アル ロ ン酸の 体内動態を探っ た。
    [0030] すなわち、 1 4 C標識 ヒ ア ル ロ ン酸を、 所属 リ ンパ節が 明かと な っている S D系雄性ラ ッ ト （体重 3 5 0 〜 5 0 0 g ) の膝関節腔な らびに大腿部皮下に投与 した。
    [0031] そ して、 採取組織は、 関節腔投与の場合には所属 リ ン パ節であ る腰椎 リ ン パ節、 非所属 リ ン パ節であ る腸管膜 リ ン パ節、 静脈内投与の場合の主代謝組織であ る肝臓お よび脾臓、 全血な らびに血漿と し た。
    [0032] ま た、 大腿皮下投与の場合には、 も う 一つの所屌 リ ン パ節であ る鼠径部 リ ンパ節を加えた。
    [0033] ま た、 組織採取時間は、 関節腔内投与の場合には投与 後 3 , 6 , 2 4 および 9 6 時問後、 大腿皮下投与の場合 には投与後 6 時間と した。 ま た、 関節腔内投与の場合に は、 投与後 6 および 2 4 時問で腰椎 リ ンパ節および肝臓 の ヒ ア ル 口 ン酸濃度 も 測定 し た。
    [0034] 第 1 図〜第 4 図は関節腔内投与後それぞれ 3 , 6 , 2 4 ， および 9 6 時問後の各組織における ヒ アル ロ ン酸分 布を示 し、 第 5 図には大腿皮下投与後 6 時間後の各組織 におけ る ヒ アルロ ン酸分布を示す。
    [0035] 各図よ り 明 らかなよ う に、 投与後のいずれの時問にお いて も、 所属 リ ンパ節に際立って高い指向性が示された。 特に投与後 3 時間の関節腔内投与においては、 所厲 リ ン パ節の放射能濃度は血漿の 2 0 0 倍以上、 肝臓の 5 0倍 以上であ り 、 所属 リ ンパ節指向性は特異的であ っ た。 ま た、 投与後 9 6 時間の所厲 リ ンパ節濃度 も高い値を維持 し、 持続性 も示唆された。
    [0036] 投与後 6 時間において、 所属 リ ンパ組織および肝臓中 の ヒ アルロ ン酸濃度を測定 した と こ ろ、 リ ンパ節におい ては高い値を示 したが、 肝臓では検出 されなかっ た。 従 つ て、 所属 リ ンパ節の放射能分布は ヒ ア ルロ ン酸の分布 を示すが、 肝臓への放射能分布は ヒ アルロ ン酸の代謝分 解物の分布を示 してい る こ と が示唆される。
    [0037] 以上の結果、 ヒ アル ロ ン酸は特異的に所属 リ ンパ節に 移行 し、 リ ンパ節で代謝分解される こ と が理解される。
    [0038] ま た、 ヒ アルロ ン酸ナ ト リ ウ ムは体内に投与された場 合、 特に腫瘍組織に特異的に渠積する こ と も 見出 された。
    [0039] そ こ で、 本発明者等は こ の よ う な高分子量 ヒ アル ロ ン 酸の優れたキ ャ リ ア ー と しての性質に着目 し、 薬効成分 と の結合について鋭意検討 したと こ ろ、 ヒ ア ル ロ ン酸の 本質的な物理化学的性質を保持 した ヒ ア ルロ ン酸ー薬効 成分結合物質の合成に成功 し たのであ る。 本発明にかかる結合物質は、 例えば癌患者の癌の近傍 の皮下組織及び筋肉組織等に投与される と、 癌と同一の 所属 リ ンパ節に特異的に移行 し、 かつ持続する。 さ ら に、 リ ンバ節での ヒ アルロ ン酸の代謝分解によ っ て抗癌剤が 定量的に遊離される。 そ して、 その優れた リ ンパ節指向 性のため副作用を殆ど示さず、 リ ンパ経由での癌の転移 をほぼ完全に抑制する。
    [0040] ま た、 ヒ アルロ ン酸が患部組織、 特に腫瘍組織に特異 的に集積する こ と によ り 、 ヒ アル ロ ン酸を薬効成分と結 合させ投与する こ とで、 低い投与量において も作用部位 に高濃度に薬効成分を集中 さ せる こ と がで き 、 薬効を効 率的に発揮させる こ とができ る。
    [0041] [図面の簡単な説明 ]
    [0042] 第 1 図〜第 4 図は膝関節腔内に 1 4 C標識 ヒ アルロ ン酸 を投与 した場合の、 所定時間経過後の各組織の 1 4 C の分 布を示す説明図、
    [0043] 第 5 図は大腿皮下に 1 4 C標識 ヒ アルロ ン酸を投与 した 場合の、 6 時間経過後の各組織の 1 4 C の分布を示す説明 図、
    [0044] 第 6 図は ヒ ア ルロ ン酸—マ イ ト マ イ シ ン C結合物質の 製造方法の説明図、
    [0045] 第 7 図は本発明にかかる ヒ アルロ ン酸ー薬効成分結合 物質のゲルろ過パ タ ー ンの説明図、
    [0046] 第 8 図は ヒ ア ル ロ ン酸ナ ト リ ウ ム と 、 本発明にかかる ヒ ア ル ロ ン酸一薬効成分結合物質の紫外部吸収スぺ ク ト ルの説明図、
    [0047] 第 9 図は ヒ アノレ ロ ン酸ナ ト リ ウ ム と、 本発明にかかる ヒ ア ル ロ ン酸—薬効成分結合物質の可視部吸収スぺ ク ト ルの説明図、
    [0048] 第 1 0図は ヒ ア ルロ ン酸一 マイ ト マイ シ ン C投与時の マ ウ ス の体重変化を、 対照およびマ イ ト マ イ シ ン C単独 投与と比較 した説明図、
    [0049] 第 1 1 図は本発明にかかる ヒ アルロ ン酸ー ダウ ノ マイ シ ン結合物質のゲルろ過パ夕 一 ンの説明図、
    [0050] 第 1 2 図は ヒ アルロ ン酸ナ ト リ ウム と、 本発明にかか る ヒアルロ ン酸ー ダウ ノ マイ シ ン結合物質の可視部吸収 スぺク ト ルの説明図、
    [0051] 第 1 3図は ヒ ア ルロ ン酸ー ダウ ノ マイ シ ン結合物質の、 中性及び 0. 1 N— N a O H溶液の可視部吸収スぺク ト ルの説明図、
    [0052] 第 1 4図は ヒ ア ルロ ン酸ー ダウ ノ マ イ シ ン結合物質の、 中性及び 0. I N— N a O H溶液の紫外部吸収スぺク ト ルの説明図、
    [0053] 第 1 5 図は ヒ アル口 ン酸ー 5 F U結合物質の製造方法 の説明図、
    [0054] 第 1 6図は ヒ ア ルロ ン酸一 5 F U結合物質の紫外部吸 収スぺ ク ト ルの説明図、
    [0055] 第 1 7 図は ヒ アルロ ン酸一 5 F U結合物質のゲル濾過 パタ ー ンの説明図、
    [0056] 第 1 8 図は ヒ ア ル口 ン酸ー ェ ピル ビ シ ン結合物 tの可 視部吸収スぺク ト ルの説明図、
    [0057] 第 1 9図は ヒ ア ルロ ン酸一ェ ビルビシ ン結合物質のゲ ル濾過パタ ー ンの説明図、
    [0058] 第 2 0図は実施例で用いたェ ビルビシ ンの検量線の説 明図、
    [0059] 第 2 1 図は ヒ アルロ ン酸ーェ ビルビシ ン結合物質をラ ッ ト大腿部皮下に投与 し、 2 4時間経過 した場合の各組 織での ヒ アルロ ン酸ーェ ビル ビシ ン結合物質の分布を示 す説明図、
    [0060] 第 2 2図は ヒ ア ルロ ン酸一サイ ト シ ン ァ ラ ビノ シ ド結 合物質の紫外部吸収スぺク ト ルの説明図、
    [0061] 第 2 3図は ヒ ア ルロ ン酸一サ イ ト シ ン ァ ラ ビノ シ ド結 合物質のゲル濾過パタ ー ンの説明図であ る。
    [0062] [発明を実施するための最良の形態]
    [0063] 以下、 図面を参照 しつつ本発明の好適な実施例につい て詳述する。
    [0064] 本発明にかかる ヒ アルロ ン酸薬効成分結合物質の一例 と して、 ヒ アルロ ン酸一抗癌剂結合物質を次のよ う に製 造する こ とができ る。
    [0065] 原料と しては、 医薬原料の高分子量 ヒ アル ロ ン酸ナ ト リ ウ ム ( Streptococcus Zooepidemicusの培费上消 -ょ ^ 精製、 赤坂 ら、 粧技誌、 ， 3 5 - 4 2 , 1 9 8 8 ) 並びに市販のマイ ト マ イ シ ン C (例えば シ グマ社製） が 使用で き る。
    [0066] 高分子と低分子薬剤の紡合法に一般的に用い られてい る と しては、 例えば臭化シ ア ン法、 過沃素酸酸化法、 ェ ビク ロ ヒ ド リ ン法、 混合酸無水物法、 カ ル ポ ジイ ミ ド法、 活性エステル法、 グルタ ルアルデ ヒ ド法及び S P D P 法 N-Succ inimidy 1 3-(2-pyridyldithio)propinate) 等 力 め る 。
    [0067] こ の う ち 、 ヒ ア ノレ ロ ン酸の グル ク ロ ン酸残基の カ ノレボ キ シル基に薬効成分をア ミ ド結合させる こ とが好適であ り 、 特に水溶性力 ルポ ジィ ミ ド化試薬 U-Ethyl-3- (3-d imethyl-aminopropyDcarbodiimide E D Cリ ま たは 1— Cyclohexyl-3-(2-morphorinyl-(4)-ethyl)-carbodiimid emethyl - p-toluenesulphonate等) を用 、る こ と ίこよ り、 ヒ アルロ ン酸の基本構造に影響を与える こ と な く 薬効成 分と グルク ロ ン酸残基のア ミ ド結合を得る こ とがで き る。
    [0068] 次によ り 具体的な実施例を示す。
    [0069] 実施例 1 ヒ ア ル ロ ン酸一 マ イ ト マ イ シ ン C結合物質 製造例 1
    [0070] 前述 したよ う に、 ヒ アル ロ ン酸自体は生体内成分であ り 、 抗原性な どの心配が全く ない ものであ る。 しか も生 体内の作用部位で徐々 に分解 されるため、 その分解に伴 い薬効成分を徐々 に しかも定量的に放出 させる こ とが期 待される。
    [0071] しか しながら、 従来の一般的な高分子物質 と薬効成分 の結合方法では、 反応の際に ヒ アルロ ン酸の基本構造が 変化 して し ま い、 期待される非抗原性、 薬効成分徐放性 を得る こ と が困難とな って し ま う 。 そ こ で、 本発明者 ら は ヒ アル ロ ン酸の基本構造を変化 さ せないよ う な、 該ヒ アルロ ン酸のグルク ロ ン酸残基を 利用 した薬効成分とのア ミ ド結合を検討 した。
    [0072] と こ ろで、 ヒ アルロ ン酸は有機溶剤に難溶で水溶液と しな ければ反応を進行させる こ とができ ない。 一方ア ミ ド化反応は脱水反応であ るため、 一般に非水系で反応を 進行さ せてい る。
    [0073] そ こ で本発明者 らは脱水反応であ るア ミ ド化反応を次 のよ う な方法 （第 6 図参照） によ り 水系で進行させ、 ヒ アルロ ン酸の基本構造を変化させず、 しか も比較的多量 の薬効成分を ヒ アルロ ン酸にア ミ ド結合させる こ とを可 能と し た。
    [0074] なお、 こ の ヒ ア ルロ ン酸一薬効成分ア ミ ド化結合物は、 生体内外において、 ヒ アルロ ン酸単独の場合と同様の反 応を示す。
    [0075] まず、 1 % ヒ ア ルロ ン酸ナ ト リ ゥ ム水溶液 1 0 m 1に 4 0 0 1の ピ リ ジ ン及び 2 mlの 2 N塩酸を加え良 く 攪捽 後、 1 M— E D C 1 ml及び 1 M— N — ヒ ド ロ キ シサ ク シ ンイ ミ ド 1 m lを加え均一にな る よ う に良く 攪拌 し、 室 温で 5 時間反応さ せる。
    [0076] 次に 2 m lの 1 M酢酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （pH 6 . 0 ) を 加え さ ら に 3 0 分間反応させる こ と によ り 過剰のカ ルボ ジィ ミ ドを分解さ せる。
    [0077] 続いて、 最終濃度 6 0 % ( w/v ) にな る よ う にァセ ト ンを攪拌 し な力《 ら加え る こ と によ り 、 沈殿を得る。 沈殿 は 3 0 0 0 rpm 3 0 分問遠心する こ と によ り 集め、 再度 約 1 % にな る よ う に 2 %酢酸ナ ト リ ウ ム に溶解、 ァ セ ト ンを加えて同様な方法によ り 沈殿を集め る。 こ のァセ ト ン沈殿操作を 3 回繰り 返すこ と によ り 、 N — ヒ ドロ キ シ サク シ ンィ ミ ド化された活性化 ヒ アルロ ン酸を得る。
    [0078] 得 られた活性化 ヒ アルロ ン酸は 1 0 m 1の 0 . 1 M リ ン 酸緩衝液 （PH 7 . 2 ) に溶解さ せ、 マイ ト マ イ シ ン じ の 1 %水溶液 2 mlを加え室温で 2 日 間反応させる。 反応終 了後 3 倍量のアセ ト ンを加えて遠心する こ と によ り 、 反 応物の沈殿を得る。 こ のアセ ト ン沈殿操作を 3 回繰 り 返 すこ と に よ り 、 純粋な ヒ ア ル ロ ン酸一マ イ ト マイ シ ン C 結合物を得る。 最終沈殿は、 室温で真空乾燥機で乾燥さ せる こ と に よ り 、 濃赤紫色の粉末を得る。
    [0079] 以上のよ う に本製造法によれば、 脱水反応であ るア ミ ド化反応を水溶液中で行わせる こ とがで き る 。
    [0080] なお、 マ イ ト マ イ シ ン C の 1 %水溶液添加量は 0 . 1 ~ 5 m lで行なわれ、 こ の場合には濃度に応 じて淡赤紫色 〜濃赤紫色の粉末とな る。
    [0081] 粉末は、 等張化 リ ン酸緩衝液に 0 . 5 % ( w/v ) に溶 解さ せ、 0 . 2 2 の メ ンブラ ンフ イ ノレタ ーでろ過する こ と によ り 無菌の注射剤とする こ とがで き る。 こ の溶液 を同緩衝液で 1 0 倍に希釈 して、 セフ ア ク リ ル S — 1 0 0 0 のゲルろ過カ ラ ム に添加 し、 力 ルバゾール · 硫酸法 及び紫外部吸収で検出 した と こ ろ、 ヒ ア ルロ ン酸の溶出 位置に一致 してマ イ ト マ イ シ ン C に由来する 3 1 0 nmの 紫外部吸収が検出 された （第 7 図参照） 。
    [0082] ま た、 得 られた ヒ ア ルロ ン酸一マイ ト マイ シ ン C結合 物質は以下の性質を有 してい る。
    [0083] ①分子量 1 0 〜 ： L 0 , 0 0 0 k d (各種分子量の ヒ アルロ ン酸で校正 したセ フ ァ ク リ ノレ S — 1 0 0 0 ク ロ マ ト グラ フ ィ一、 ま たは極限粘度法によ り 算出 し た）
    [0084] ②抗癌剤 （マ イ ト マ イ シ ン C ) の結合量
    [0085] 重量％で 0 . 1 〜 3 0 重量％ (カ ルボキ シル基活性化 剤であ る カ ルポ ジイ ミ ドの量、 反応に用い る抗癌剤の量 を変え る こ と によ り 結合量を変化させる こ とが可能であ る）
    [0086] ③性状 ： 0 . 5 % ( w/v) 水溶液にて淡赤紫色〜濃赤紫 色。 無臭。
    [0087] ④溶解性 ： 水、 生理食塩液、 等張化 リ ン酸緩衝液に可溶。 メ タ ノ 一 ノレ、 アセ ト ン、 エー テル、 ク ロ 口 ホ ルム に不溶。
    [0088] ⑤呈色反応 ： 力 ルバゾー ル · 硫酸反応、 酸加水分解後ェ ルソ ン · モルガン反応に陽性。
    [0089] ⑥紫外部吸収 ： 2 5 2 nm， 3 1 0 に ピー ク を有 し、 ま た 3 6 0 nm付近に紫外部吸収の肩を有する。
    [0090] ⑦抗癌剤の遊離 ： 生体内での ヒ アルロ ン酸の分解に伴つ てマイ ト マイ シ ン Cが遊離さ れる。 ま た、 強アルカ リ 処 理する こ と によ り ア ミ ド結合が加水分解 し、 マ イ ト マ イ シ ン C が遊離される。
    [0091] ⑧ゲルろ過パ タ ー ン ： セ フ ァ ク リ ノレ S — 1 0 0 0 のゲル ろ過カ ラ ム に添加後カ ルバゾ一 ル ' 硫酸反応を行な う と 分子量 5 0 0 kdの と こ ろに結合物質の ピー ク が観察され る。 ま た、 同 じ位置にマイ ト マイ シ ン C に起因する紫外 部吸収が観察される （第 7 図参照） 。
    [0092] ま た、 水に溶解させた と き ヒ アルロ ン酸ナ ト リ ウ ム 自 身には 2 3 0 nm以上の紫外部吸収はないが、 本実施例に かかる ヒ アルロ ン酸一マイ ト マイ シ ン C結合物質では 2 5 2 nm, 3 1 0 nmに ピー ク を、 ま た 3 6 0 nm付近に紫外 部吸収の肩を認めた （第 8 図参照） 。
    [0093] また可視部では、 5 2 8 nmを中心とするブ ロ ー ドな吸 収が観察された （第 9 図参照） 。
    [0094] なお 0 . 1 N の酸性条件下では、 遊離マイ ト マイ シ ン C の場合において も、 結合物質の場合において も 2 4 5 nm付近に紫外部吸収を認めた。 ま た、 遊離マイ ト マ イ シ ン C の場合には、 酸性条件下での芳香環ァ ミ ノ 基の安定 化に基づく 3 0 8 nmの吸収も新たに認め、 吸収波長は結 合体の もの とほぼ一致 した。
    [0095] ま た、 本実施例では、 マイ トマイ シ ン C の結合量 （重 量％ ) は、 遊離マ イ ト マイ シ ン C及び結合体の 2 4 5 n mにおけ る吸光度から算出 して 1 1 . 5 %であ り 、 遊離 カ ルボキシル基の内の約 1 Z 6 がマイ ト マィ シ ン C に置 換された。
    [0096] なお、 本発明のキャ リ ア一 と して使用 されてい る ヒ ア ルロ ン酸ナ ト リ ウ ムは、 も と も と結合組織等に多 に存 在する生体成分であ り 、 ま た リ ンパ節で完全に分解され た後は、 主と して炭素源と して再利用さ れる ので、 従来 使用 されてい る高分子キヤ リ ア一 と比較 して顕著に安全 性が高い。
    [0097] ま た、 こ の ヒ ア ルロ ン酸一抗癌剤結合物質は、 その優 れた リ ンパ節指向性のため リ ンパ節以外の抗癌剤の濃度 は、 抗癌剤単独投与と比較 して数十分の一以下であ るの で、 超早期癌、 癌の診断が確定 していな い患者に も転移 予防の 目的で安全に適用する こ と ができ る。
    [0098] さ ら に ヒ アル口 ン酸の癌組織指向性によ り 体内でのマ ィ ト マ イ シ ン C の濃度を低く 抑えつつ、 患部組織で効率 的に薬効を発揮さ せる こ とがで き る。
    [0099] 製造例 2
    [0100] 0 . 5 % ヒ アルロ ン酸ナ ト リ ウ ム水溶液 1 2 0 m lに 2 m lの ピ リ ジ ン及び 1 0 mlの 2 N— H C 1 を こ の順 ¾に加 え、 P H 4 . 7 5 に調製する。 続いて 2 g の 1 —ェチル 一 3 — ( 3 — ジ メ チルァ ミ ノ プロ ピル） カ ルポ ジ イ ミ ド ( E D C ) な ら びに 1 . 5 g の N — ヒ ド ロ キ シ コ ハ ク酸 イ ミ ドを加え室温で 5 時間反応さ せて ヒ アル ロ ン酸の力 ルポキ シル基を活性化させた。 過剰の E D C を 1 Mの酢 酸ナ ト ウ リ ム溶液の添加によ り 分解させた後、 3 回のァ セ ト ン沈殿によ り 活性化 ヒ ア ルロ ン酸ナ ト リ ゥ ムを精製 した。 活性化 ヒ ア ルロ ン酸ナ ト ウ リ ムは 1 2 0 m 1の 0 . 1 M リ ン酸緩衝液に溶解後 3 0 0 mgのマイ ト マイ シ ン C を加え、 室温で 2 日間反応さ せた。 反応物は上記と 同様 に 3 回のァセ ト ン沈殿によ り 精製 し、 約 6 0 0 mgの純粋 な ヒ ア ル ロ ン酸一 マイ ト マ イ シ ン C結合物質を得た。 こ の よ う に して得 られた ヒ ア ノレ ロ ン酸一マ イ ト マ イ シ ン C結合物質の極限粘度よ り 求めた分子量は 2 2 7 k d であ り 、 結合率は 3. 5 % ( w / w ) であ っ た。
    [0101] 転移抑制試験①
    [0102] 次に本実施例にかかる ヒ アルロ ン酸一マイ ト マイ シ ン C結合物質の転移抑制効果試験について説明する。
    [0103] 製造例 2で得られた結合物質を 4 % ( w / V ) の濃度 と な る よ う に注射用生理食塩液に溶解さ せ、 生理^塩液 を対照と して転移抑制効果をマイ ト マイ シ ン C単独投与 の場合と比較検討 した。
    [0104] C 5 7 B L Z 6雌性マ ウ ス （ 6週齢） の側腹部皮下に L e w i s l u n g c a r c i n o m a細胞を l x 1 0 5個 マ ウ ス に接種 した。 実験は一群 6 匹を用いた。 薬物は注射用生理食塩溶液に溶解 し、 投与はマイ ト マ ィ シ ン C に換算して 0. 5 , 1 . 0 , 5. 0 mg/kgの 3水 準を腫瘍移植部の反対側の側腹部皮下に行っ た。
    [0105] 単回投与は癌細胞接種後 1 日 目、 連続投与は接種後 1 日 目、 3 日 目、 5 日 目 に行っ た。 担癌マ ウ スは腫瘍移植 後 2 2 日 目 に屠殺 し、 肺転移癌細胞重量を測定 した。 抗 腫瘍効果の評価は、 次式で示される腫瘍阻止率によ り 行 い、 結果を表 _ 1 に示す。
    [0106] 腫瘍阻止率 = 1 0 0 X (対照群の肺転移癌細胞重 I 一投 与群の肺転移癌細胞重量） / (対照群の肺転移癌細胞重 表一 薬物 投与量（mg/kg) X回数 阻止率 ( % )
    [0107] ¾眧群 0 0 結合物質 1 . 0 X 1 6 4. 6
    [0108] 5. 0 X 1 5 7. 4 マ イ ト マ イ シ ン C 1 . 0 X 1 - 1 4. 9
    [0109] 5. 0 X 1 8 3. 4 結合物質 0. 5 X 3 9 9. 4
    [0110] 1 . 0 X 3 6 3. 5 マ イ ト マ イ シ ン C 0. 5 X 3 5 1 . 1
    [0111] 1 . 0 X 3 3 0. 5 以上の結果よ り 明 らかなよ う に、 本実施例にかかる ヒ ァ ノレ 口 ン酸 ー マィ ト マイ シ ン C結合物質は単回、 速続投 与 に お いて、 マィ ト マィ シ ン C単独投与よ り も優れた肺 転移抑制効果を示 し、 特に連続 3 回投与においては著効
    [0112] ¾r示 し た。
    [0113] 転移抑制試験
    [0114] 次に、 ヒ アルロ ン酸一マ イ ト マ イ シ ン C結合物質の リ ンパ節経由転移抑制効果について説明する。
    [0115] 前記製造例 2で得 られた結合物質を 4 % ( W/V) の濃 度に注射用生理食塩溶液に溶解さ せ、 生理食塩液投与群 を対照と して、 リ ンパ節転移抑制効果をマイ ト マィ シ ン C単独投与群の場合と比較 し た。
    [0116] すなわち C 3 H / H e雌性マ ウ ス の足踱皮下に 1 X 1 0 6個の M H— ] . 3 4腹水肝癌細胞を移植 し た。 実験は —群 6 匹を用いて行い、 投与 Sはマイ ト マイ シ ン C に換 算 して 0 . 1 および 1 mg/kgの 2 水準と した。 投与は移 植翌日 よ り 癌移植 した同足側の大腿部皮下に 3 回 Z週の 間隔で行い、 移植後 2 1 日 目 に動物を屠殺 し、 癌移植 し た同足側の鼠径部 リ ンパ節の短径 （ mm) および長径 （mm) を測定 し、 腫瘍径をその積で示 した。 ま た、 摘出 した各 リ ンパ節組織はホルマ リ ン固定を行い、 病理学的検査を 実 S也した。
    [0117] 結果を表一 2 に示す。
    [0118] 表一 2
    [0119] 群 投与量 投与部位 投与間隔 腫瘍径 コントロール 大腿皮下 3 回/週 71.2± 35 .9
    [0120] HA-MMC 0. lmg/kg 大腿皮下 3 回 Z週 22.9土 5 .3
    [0121] HA-MMC 1. Omg/kg 大腿皮下 3 回/週 32.0土 14 .6
    [0122] M M C 0 - lmg/kg 大腿皮下 3 回 Z週 .4
    [0123] M M C 1. Omg/kg 大腿皮下 3 回 Z週 全例死亡 リ ンパ節は癌の リ ンバ節転移によ って も、 ま た ヒ アル ロ ン酸の単独投与によ って も肥大する。 しか し、 +1ヒ アル ロ ン酸一マ イ ト マ イ シ ン C結合物質の 0 . 1 mg/kg投与 群の リ ンパ節の大き さ は、 マイ ト マ イ シ ン C 単独投与群 と ほぼ同 じであ り 、 マイ ト マ イ シ ン C単独投与群に比べ 強い転移抑制効果が認め られた。 1 mg投与群では抗癌剂 の副作用減弱と と も に、 強い転移抑制作用が観察された ま た、 病理学的検査において、 結合物質投与群は、 単独 投与群と比較 して癌の広範な壊死が観察され、 こ の面か ら も強い転移抑制作用が ¾付け られた。
    [0124] 腫瘍 ^抑制試験① 次に ヒ アルロ ン酸一マイ ト マイ シ ン C結合物質の M e t h A腫瘍に対する腫瘍抑制効果について説明する。 製造例 2 で得 られた結合物質を 4 % ( W/V) の濃度と な る よ ό に注射用生理食塩液に溶解さ せ、 生理食塩液投 与群を対照と して腫瘍増殖抑制効果をマ イ ト マイ シ ン C 単独投与群の場合と比較 した。
    [0125] 雌性マウ スの背部皮下に 1 X 1 0 6個の M e t h A腫 瘍を移植 し た。 実験は一群 5 匹を用いて行い、 投与量は マイ ト マイ シ ン C に換算 して 0. 1 および 1 mg/kgと し た。 投与は移植翌日 よ り 3 回 /週の間隔で腹腔内に行い、 移植後 2 1 曰 目 に動物を屠殺 し、 癌組織の短径および長 怪を測定 した。 なお、 結果は短径 ( mm) と長径 ( mm) の 平均 { (短径 +長径） / 2 } で示 した。 ま た、 投与 1 4 および 2 1 日 目 には体重 も測定 し
    [0126] 結果を次の表一 3 に示す。
    [0127] 表一 3
    [0128] 群 投与量 投与部位 投与間隔 腫瘍怪 コント Π—ル 腹腔 3 回 Z週 21 .2± 0. 8
    [0129] HA-MMC 腹腔 3 回ノ週 17 .4± 5 · 1
    [0130] HA-MMC 1 - Omg/kg 腹腔 3 回 Z週 19 .9± 4. 7
    [0131] M M C 0. Irag/kg 腹腔 3 回 Z週 19 .9± 6. 6
    [0132] M M C 1. Omg/kg 腹腔 3 回 /週 25 • 7± 1. 0 本腫瘍のマイ ト マイ シ ン C に対する感受性は弱 く 、 マ ィ ト マイ シ ン C の 1 mg/kgの投与では投与群の腫瘍がコ ン ト ロ ール群よ り 大であ っ た。 しか し、 感受性は低いな 力 ら も、 ヒ ア ル ロ ン酸一 マ イ ト マ イ シ ン C結合物锊はマ ィ ト マイ シ ン C単独投与を上回る抗腫瘍効果を示 した。 なお、 第 1 0 図に試験期間中の体重変化を示す。
    [0133] 同図よ り 、 マイ ト マイ シ ン C単独の 0 . 1 mg/k g投与 量で、 投与後 1 4 日 にかけて体重抑制が観察されたが、 ヒ アル ロ ン酸一マイ ト マイ シ ン C結合物質投与群は体重 抑制が観察されず、 副作用の低減が示された。
    [0134] 腫瘍増殖抑制試験②
    [0135] 次に ヒ アルロ ン酸一マイ ト マイ シ ン C結合物質の M H - 1 3 4腫瘍に対する腫瘍抑制効果について説明する。
    [0136] 製造例 2 で得 られた結合物質を 4 % ( W/V) の濃度と な るよ う に注射用生理食塩液に溶解させ、 生理食塩液投 与群を対照と して腫瘍増殖抑制効果をマイ ト マイ シ ン C 単独投与群の場合と比較 した。
    [0137] C 3 H / H e 雌性マ ウ スの背部皮下に 1 X 1 0 6個の M H - 1 3 4腹水肝癌細胞を移植 した。 実験は一群 6 匹 を用いて行い、 投与量はマイ ト マイ シ ン C に換算 して 0. 5 mg/ kgと した。 投与は移植翌日 よ り 3 回 /週の問隔で 腹腔内に行い、 移植後 2 1 日 目 に動物を屠殺 し、 癌組織 の短径および長径を測定 した。 なお、 結果は短径 （ mm) と長径 （mm) の積 （短径 X長径） で示 した。
    [0138] ま た、 摘出 した各癌組織はホルマ リ ン固定を行い、 病 理学的検査を実施 した。
    [0139] 結果を表一 4 に示す。
    [0140] 表—
    [0141] 群 投与量 投与部位 投与問隔 腫《5径 コント n-ル 一 腹腔 3 回 Ζ週 461 ± 227
    [0142] HA-MMC 0.5mg/kg 腹腔 3 回ノ週 81 ± 84 M M C 0.5mg/kg 腹腔 3 回 Z週 196± 100 こ の結果、 マイ ト マイ シ ン Cのみを投与 し た場合よ り も、 ヒ アルロ ン酸に結合さ せた場合の方がは るかに腫瘍 増殖を抑制 してい る こ とが示唆され、 癌タ ーゲ ッ テ ィ ン グ療法に好適であ る こ とが理解される。 実施 _例 2 ヒ ア ル ロ ン酸ー ダウ ノ マイ シ ン ^合物 t 製造例 1
    [0143] 前述 したよ う に 、 ヒ ア ル ロ ン酸は水溶性で 、 有機溶媒 には難溶であ る 0 —方、 ダウ ノ マイ シ ン等の多 く の薬効 成分は有機溶媒に易溶で、 水には難溶であ る
    [0144] そ こ で、 こ のよ う な水難溶性の薬効成分を ヒ ア ノレロ ン 酸に効率的にァ ミ ド結合させるため、 本発明者 ら は次の よ う な製造方法を採用 した。
    [0145] 1 % ヒ ア ノレ 口 ン酸ナ ト リ ゥ ム水溶液 2 5 m 1に 1 m 1の ピ リ ジ ン 、 5 m 1の 2 N塩酸及び 1 5 mlの ジ メ チ ル ホ ル ムァ ミ ドを加えよ く 攪拌後、 0. 6 gの N— ヒ ド ロ キ シ こ は く 酸ィ ミ ド及び 1 gの E D Cを加え室温で 2時問反応さ せる こ と によ り ヒ アルロ ン酸のカ ルボキ シル基を活性化 させる。
    [0146] 続いて 5 Mの リ ン酸 2 カ リ ウ ムを滴下 し、 p Hを 7. 4 にする と 同時に過剰の E D Cを分解する。 2 0 mgの ε ーァ ミ ノ 力 プロ ン酸を加えて 2時問室温で反応さ せ、 メ チ レ ン基 5個を介 してカ ルボキ シル基を ヒ アル口 ン酸に 導入する。 5 N— N a O Hを加えて p Hを 1 2 とする こ と によ り 不安定な結合を除去する。 そ して、 酢酸を滴下 し中和する。
    [0147] 1 0 O mlのエ タ ノ ー ルを徐々 に攪拌 しな力 ら加え ヒ ア ルロ ン酸を沈殿さ せる （エ タ ノ ール沈殿） 。 こ の操作を 2度繰り 返 し低分子物質をすベて除去する。
    [0148] スぺ—サーを導入 した ヒ アルロ ン酸 1 0 0 mgを 9 mlの 蒸留水に溶解する。 1 mlの ピ リ ジ ン、 5 mlの 2 N塩酸及 び 4 mlの ジ メ チルホルムァ ミ ドを加え混合 して均一溶液 とする。 2 0 mgの ダウ ノ マイ シ ンを加えた後、 1 0 0 mg の E D Cを攪拌 し なが ら徐々 に加え反応を開始する。 5 時間経過 した後 2 mlの 1 M酢酸ナ ト リ ゥ ム緩衝液を加え 3 0分間攪拌する こ と によ り 過剰の E D Cを分解さ せる。
    [0149] 3 0 mlのァセ ト ンを攪拌 し なが ら徐々 に滴下 し ヒ アル ロ ン酸を沈殿させる。 沈殿は遠心操作に よ り 回収する。 こ のアセ ト ン沈殿操作を 3回繰り 返すこ と に よ り 、 純粋 な ヒ ア ルロ ン酸ー ダウ ノ マイ シ ン結合物を得る。 最終沈 殿は、 室温で真空乾燥機で乾燥さ せる こ と に よ り 、 橙色 の粉末を得る。
    [0150] 粉末を等張化 リ ン酸緩衝液に 0. 5 % ( W/V) とな る よ う に溶解さ せ、 0. 2 2 の メ ンブラ ン フ イ ソレ タ ーで 濾過する こ と によ り 無菌の注射剤とする こ と ができ る。 こ の溶液を同緩衝液で 5倍に希釈 して、 セ フ ア ク リ ル S 一 2 0 0のゲル濾過カ ラ ム に添加 し、 カ ノレバゾール . 硫 酸法及び 4 7 5 nmの可視部の吸収で検出 した と こ ろ 、 ヒ ア ル ロ ン酸の溶出位置に一致 してダウ ノ マイ シ ン に起因 する 4 7 5 nmの可視部吸収が検出 された （第 1 1 図参照）。
    [0151] ま た 、 得 られた ヒ ア ル ロ ン酸一 ダ ウ ノ マ イ シ ン結合物 質は以下の性質を有 している。
    [0152] ①分子量 1 0 〜 1 0 ， 0 0 0 kd (各種分子量の ヒ アルロ ン酸で校正 したセ フ ァ ク リ ノレ S — 1 0 0 0 ク ロ マ ト グラ フ ィ 一 、 ま たは極限粘度法によ り 算出 し た）
    [0153] ②抗癌剤 （ダウ ノ マ イ シ ン） の結合量
    [0154] 重量％で 0 . 1 〜 3 0重量％ ( カ ルボキ シ ル基活性化 剤であ る カ ルポジイ ミ ドの量、 N — ヒ ドロキ シ こ は く 酸 イ ミ ド、 スぺーサ一の ε —ァ ミ ノ カブロ ン酸、 反応に用 いる抗癌剤の量、 反応時間等を変える こ と に よ り 結合量 を変化させる こ と が可能であ る。 ）
    [0155] ③性状 ： 0 . 5 % ( W/V) 水溶液に て淡橙色〜濃橙色。 無臭。
    [0156] ④溶解性 ： 水、 生理食塩液、 等張化 リ ン酸緩衝液に可溶。 メ タ ノ 一 ノレ、 エ タ ノ ー ノレ、 ア セ ト ン 、 エ ー テ ル、 ク ロ 口 ホ ルム に 不溶。
    [0157] ⑤呈色反応 ： 力 ルバゾール · 硫酸反応、 ニ ン ヒ ド リ ン反 応、 酸加水分解後エル ソ ン · モ ル ガ ン反応に陽性。
    [0158] ⑥吸収スぺク ト ノレ ： 4 7 0 〜 5 0 0 nmにかけてなだ ら力、 な可視部の吸収を示 し、 遊離ダウ ノ マイ シ ン の ス ぺ ク ト ルに一致する。 ま たアルカ リ 性条件下においては、 5 5 0 nmと 5 9 0 nmに シフ トする。 こ れは、 ダウ ノ マイ シ ン のフ エ ノ ール性水酸基の存在によ る ものであ る。 紫外部 については 2 5 5 nmに吸収の ビー ク を示す （第 1 2 図、 第 1 3 図、 第 1 4 図参照） 。
    [0159] ⑦ゲル濾過パタ ー ン ： セフ ァ ク リ ノレ S — 2 0 0 のゲル濾 過カ ラ ム に添加後力 ルバゾール · 硫酸法を行な う と試験 管番号 1 5 香の と こ ろ に結合物質の ビー ク が観察さ れる。 ま た、 4 7 5 n mで検出する と ダウ ノ マイ シ ンに起因す る可視部の吸収 （橙色） が観察される （第 1 1 参照） 。
    [0160] 製造例 2
    [0161] 本発明者 らは ヒ アルロ ン酸を有機溶媒可溶とする ため、 ァセチル化 ヒ アルロ ン酸を用い、 有機溶媒系で薬効成分 との結合を行う こ とを検討 した。
    [0162] すなわち、 ァセチル化 ヒ ア ルロ ン酸 5 0 O mgを、 よ く 脱水 し た 1 0 0 m 1の ジ メ チルホルムア ミ ド （ 0 . 5 % , W/V) に攒拌溶解する。 溶解後、 — 8 〜 一 1 0 °Cに冷却 する。
    [0163] 攪拌 しな力 ら、 1 m lの ク ロ 口蟻酸イ ソ ブチル及び ト リ ェチルァ ミ ンを加え、 一 8 〜 一 1 0 °Cで 9 0 分問反応さ せ、 ァセチル化 ヒ アル口 ン酸のカ ルボキ シル基を活性化 する。
    [0164] 3 0 0 mgの ダウ ノ マ イ シ ン を 1 0 m lの ジ メ チルホ ノレ厶 ア ミ ド並びに 1 m lの ト リ エチルァ ミ ンの混液に溶解さ せ 氷冷する。 こ の ものをァセチル化 ヒ アル ロ ン酸溶液に加 え、 搲拌 し ながら 0 でで一晩反応させる。
    [0165] こ の後、 あ らか じめ氷冷 した 1 5 0 m lの精製水中に反 応液を投入 し反応を停止する。 そ して、 p H 1 2. 5 に な る よ う に 5 N— N a 0 Hを加え、 室温で 2 時間拟拌 し てァセ チル基を除去 し、 5 M酢酸を加え中和する。
    [0166] 3倍量のアセ ト ンを加え、 合成された ヒ ア ル ロ ン酸— ダウ ノ マイ シ ン結合物を沈殿さ せる。 沈殿は遠心操作に よ り 回収する。
    [0167] 沈殿を 5 0 mlの 1 0 0 mM酢酸ナ ト リ ウ ム緩衝液 （ p H 6. 0 ) に溶解する。 3倍量のアセ ト ンを加え、 ヒ ア ル ロ ン酸ー ダウ ノ マイ シ ン結合物を沈殿さ せ、 遠心操作に よ り 回収する。 以上のアセ ト ン沈殿操作を 3 回繰 り 返す こ と に よ り 、 純粋な ヒ アルロ ン酸ー ダウ ノ マ イ シ ン結合 物を得る。 最終沈殿は、 室温で真空乾燥機によ り 乾燥さ せる こ とで、 橙色粉末を得る。
    [0168] 粉末は製造例 1 と同様に処理する こ と によ り 、 無菌の 注射剤とする こ とがで き る。
    [0169] ま た、 本実施例では、 ダウ ノ マイ シ ン の結合量 （重量 % ) は、 遊離ダウ ノ マイ シ ン及び結合体の 4 7 5 nmにお ける吸光度から算出 して、 2 9. 6 %であ っ た。 ま た、 分子量は極限粘度法によ り 求めた と こ ろ、 5 1 . 7 kdで あ っ た 0
    [0170] なお、 本製造例では、 非水溶液中での反応と して、 ク ロ ロ蟻酸イ ソ ブチルを使用 してい るが、 縮合剤と して N, N-Bis[2-oxo-3-oxazolidinyl]phosphorodiamidic Chi or ide等を用いる こ と もで き る。
    [0171] 以上のよ う に本製造例によれば、 有機溶剂可溶性のァ セチル化 ヒ アルロ ン酸を用いて、 非水溶液中で結合反応 を行なわせるため、 水溶液中では困難な合成反応を実施 する こ とで、 初めて可能にな っ た例であ る。 実施例 3 ヒ ア ルロ ン酸一 5 F U結合物質
    [0172] 製造例 1
    [0173] 第 1 5 図に示すよ う な方法によ り 、 ヒ アル ロ ン酸一 5 F U結合物質を得た。
    [0174] すなわち、 ァセチル化 ヒ アルロ ン酸 5 0 0 mgおよび 5 一フ ルォ ロ ウ ラ シ ル （ 5 F U ) 2 5 0 mgを 5 O mlの ピ リ ジ ン に溶解する。
    [0175] 別に、 0. 9 m 1の メ チノレ p — ト ノレエ ン ス ルフ ォ ン酸に 0. 5 5 mlの 2 —ク ロ 口 ピ リ ジ ンを加え、 3 0分問攪拌 する こ と によ り ピ リ ジニゥ ム塩を調製 してお く 。 ピ リ ジ 二ゥ ム塩溶液を攪拌さ せなが ら、 先の ヒ アル ロ ン酸、 5 一 F Uの ピ リ ジ ン溶液を徐々 に滴下する。 均一と し た後、 温度を 5 0 と し、 3 6時間反応させた。
    [0176] 反応終了後、 反応液を氷冷 し、 5倍量の n —へキサ ン を加え、 合成されたァセチル化 ヒ アルロ ン酸— 5 F U結 合物質を沈殿さ せる。 沈殿は 0 で遠心する こ と によ り 回収する。 次に沈殿の半量を 2 5 mlの ジ メ チルホルムァ ミ ドに溶解 し、 5 倍量の精製水を加え る こ と に よ り 目的 の結合物質を沈殿させた。
    [0177] 以上の水沈殿操作を 3回繰返すこ と によ り 、 純粋なァ セチル化 ヒ ア ルロ ン酸一 5 F U結合物 を得た。 最終沈 殿は、 室温で真空乾燥器によ り 乾燥さ せる こ と によ り 、 1 4 8 mgの白色粉末を得た。 なお、 5 F Uの結合率は正 確に算出するためァセチル基を除去 して測定 し た と こ ろ、 2 . 0 %であ っ た。 沈殿の一部をエタ ノ ールに溶解 して 紫外部吸収を測定 した と こ ろ、 5 F U に起因する 2 6 0 nmの紫外部吸収が観察された （第 1 4図） 。 更に、 ゲル 濾過法によ り ヒ アルロ ン酸 （ 5 3 0 nm) と 5 F U ( 2 6 0 nm) の溶出パタ ー ンを比較 した と こ ろ、 両者はほぼ一 致 し （第 1 7 図） 、 ヒ アルロ ン酸— 5 F U結合物 Kが生 成 している こ とが示唆される。
    [0178] ま た、 分子量は製造例 1 の ヒ アル ロ ン酸一 5 F U結合 物質の分子量にァセチル残基の分子量を和 して、 約 1 7 0 k dと算出 された。
    [0179] ま た、 本実施例によ り 得られる ァセチル化 ヒ アル ロ ン 酸一 5 F U結合物質は脂溶性であ り 、 少量のエタ ノ ール 等の有機溶媒に溶解 し た後、 生理食塩水を添加する と ゲ ルと な る。 こ のた め、 こ のゲルを癌部位の所属 リ ンパ節 に埋め込むと徐々 にゲルが崩壊 し、 長時間にわた り 持続 的に リ ンバ節にァセチル化 ヒ アルロ ン酸一 5 F U結合物 質が移行 し、 リ ンパ節転移の予防に も顕著に効果を有す る
    [0180] ま た、 ゲルであ るため癌に直接埋め込むこ と も に可能 であ り 、 癌部位の抗癌剂の濃度が他の投与方法と比較 し て著 し く 高 く 推移する ため、 癌の著 し い退縮効果が期待 される。 更に動脈内投与する こ と によ り 、 癌部位の勁脈 が栓塞 し、 容易な癌栓塞投与剤と な り 、 高い抗腫瘍効果 が期待でき る。
    [0181] こ の よ う に、 ァセチル化 ヒ ア ル ロ ン酸一 5 F U結合物 質は、 その物理化学的性質のため、 大変有用性の高い も のであ る。
    [0182] 製造例 2
    [0183] 前記製造例 1 のァセチル化 ヒ アルロ ン酸— 5 F U結合 物質を 0. 1 Nの N a O Hに懸濁 させ、 室温で 2時問攒 拌する こ と によ り ヒ アルロ ン酸の水酸基に結合 したァセ チル基を切断除去 した。 5 M酢酸を加えて中和後、 3倍 量のァセ ト ンを加え合成された ヒ アルロ ン酸一 5 F U結 合物質を沈殿させる。 沈殿は遠心操作によ り 回収する。
    [0184] 沈殿を 2 5 mlの 1 0 0 mM酢酸ナ ト ウ リ ム緩衝液 （ p H 6. 0 ) に溶解する。 3倍量のアセ ト ンを加え、 ヒ ア ル ロ ン酸一 5 F U結合物質を沈殿さ せ、 遠心操作によ り 回 収する。 以上のアセ ト ン沈殿操作を 3回繰返すこ と によ り 、 純粋な ヒ アル ロ ン酸一 5 F U結合物質を得る。 最終 沈殿は、 室温で真空乾燥器によ り 乾燥さ せる こ と によ り、 白色粉末を得る。
    [0185] 粉末は、 等張化 リ ン酸緩衝液に 0. 5 % ( W/V) と な る よ う に溶解さ せ、 0 . 2 2 の メ ン ブラ ン フ ィ ル タ ー で濾過する こ と によ り 無蘭の注射剤とする こ とがで き る。
    [0186] ま た、 本実施例では 5 F Uの結合量 （重量％ ) は、 遊 離 5 F Uおよび結合体の 2 6 0 nmにおけ る吸光度か ら算 出 して 2. 3 %であ っ た。 ま た、 分子量は極限粘度法によ り 求めた と こ ろ、 1 4 5 k dであ っ た。
    [0187] なお、 本製造法ではァセチル化 ヒ アル ロ ン酸を出発原 料と してい る と こ ろ に特徴を有 し、 有機溶媒中で反応が 行え る ため可能と な っ た方法であ る。 実施例 4 ヒ ア ルロ ン酸ー ェ ビル ビシ ン結合物質
    [0188] 製造例
    [0189] ァセ チル化 ヒ ア ルロ ン酸 1 . 5 g をよ く 脱水 し た 1 0 0 m lの ジ メ チルホ ルム ア ミ ドに 1 % ( W/V) の濃度と な る よ う に溶解する。 約一 1 0 eCに冷却後、 液を攪拌させ なが ら 、 7 5 0 1の ク ロ 口蟻酸イ ソ ブチルおよ び ト リ ェチルア ミ ンをこ の順番にゆ つ く り 滴下する。 攪拌を更 に 1 時間続け、 ァセチル化 ヒ ア ル ロ ン酸のカ ルボキ シ ル 基を活性型に変換する。
    [0190] 2 5 0 mgのェ ビル ビ シ ンを 1 0 m lの ジ メ チルホ ルム ァ ミ ドに溶解する 。 溶解後 7 5 0 ; 1の ト リ エ チルァ ミ ン を加え、 0 °Cに冷却する。 こ の ものをァセチル化 ヒ アル ロ ン酸溶液に徐々 に滴下する。 ゆ っ く り 全体を攪抨さ せ なが ら、 4 °Cで一晚反応さ せる。
    [0191] 反応終了後、 予め氷冷 し た 2 0 0 m lの精製水を加え、 反応を停止さ せる。 p H l 2 〜 ： 1 3 にな る よ う に 5 N — N a 0 Hを攪拌 しなが ら加え、 4 で 2 時間反応 し、 0 一ァセチル基を除去する。 5 M酢酸を加え中和 し、 ヒ ア ル ロ ン酸ー ェ ピル ビシ ン結合.休の濃赤色沈殿が析出する までアセ ト ンを加える。 0. 1 M酢酸ナ ト ウ リ ム緩衝液 で沈殿を 2 回遠心洗浄 し、 未反応のェ ピル ビ シ ンを除去 する。
    [0192] 最終沈殿は、 真空乾燥器で減圧乾燥さ せる こ と によ り、 ヒ アルロ ン酸ーェ ビル ビシ ン結合体の純品を得る こ と力 でき る。 本品は濃赤色の粉末であ る。
    [0193] 本品は注射用生理食塩液に一部溶解 し なが らゲル状に 懸濁 し、 皮下および腹腔内投与剤等の注射剤にする こ と がで き る。
    [0194] 本品は 2 0〜 4 0 %のエタ ノ ールま たはプロ ピ レ ング リ コ ールを含む注射用生理食塩液に溶解 し、 0. 2 2 μ mの メ ン ブラ ン フ ィ ルタ 一で濾過する こ と に よ り 無菌の 注射剤にする こ とがで き る。
    [0195] また、 本実施例ではェ ビル ビシ ンの結合量 （重量％ ) は、 遊離ェ ビルビシ ンおよび結合体の 4 9 5 nmにおける 吸光度か ら算出 して 1 2. 7 %であ っ た。 ま た、 分子量 は分子量校正曲線を作製 してゲル濾過での溶出位 ^か ら 求めた と こ ろ、 7 0 kdであ っ た。
    [0196] 次に本実施例にかかる ヒ ア ルロ ン酸一ェ ピル ビシ ン結 合物質の性状を示す。
    [0197] ①分子量 ： 1 0〜 1 0 , 0 0 0 kd
    [0198] ②抗癌剂 （ェ ビル ビ シ ン） の結合量 ： 0. 1 〜 4 5 :量 %
    [0199] ③性状 ： 0. 5 % ( /V) 水溶液ま たは水系溶液あ るい は懸濁液にて淡〜濃赤色透明、 無臭。 ④溶解性 ： 結合率の比較的低い場合には水、 生理^塩液、 等張化 リ ン酸緩衝液に可溶、 結合率が高い場合には水、 生理食塩液、 等張化 リ ン酸緩衝液に難溶。 2 0〜 4 0 % エタ ノ ールま たはプロ ピ レ ン ダ リ コ ールを含む生理食塩 液に可溶。 いずれ もエ タ ノ ールおよびア セ ト ン に難溶。 エーテルおよびへキサ ンに不溶。
    [0200] ⑤呈色反応 ： 力 ルバゾール · 硫酸反応、 酸加水分解後ェ ル ソ ン · モルガ ン反応に陽性。
    [0201] ⑥可視部吸収 ： 4 7 0〜 4 8 0 nmにブロ ー ドな ビー ク を、 4 5 0 および 4 9 0 nm附近に吸収の肩が観察される （第 1 8 図） 。
    [0202] ⑦抗癌剤の遊離 ： 生体内での ヒ アルロ ン酸の代謝分解に 伴ってェ ビルビシ ンが遊離される。
    [0203] ⑧セフ ァ ク リ ノレ S — 3 0 0 を支持体とするゲル濾過カ ラ ムに添加後、 カ ルバゾ一ル · 硫酸反応を行う と、 分子量 約 7 0 kdの位置に結合物質の ピー ク が観察さ れる。 ま た、 同 じ位置にェ ビル ビ シ ン に起因する紫外部吸収が観察さ れる （第 1 9 図）
    [0204] 体内動態試験
    [0205] 次に、 ヒ アルロ ン酸—ェ ピル ビ シ ン結合体の体内動態 試験の結果について説明する。
    [0206] 使用 した ヒ ア ル ロ ン酸ーェ ピル ビ シ ン結合体は、 前記 製造例で製造 した ものを 1 % ( W/V) の濃度と な る よ う に生理食塩液に懸濁さ せて投与液と した。
    [0207] 動物は体重 4 0 0〜 5 0 0 g の S D系雄性ラ ッ ト （一 群 5 匹） を使用 し、 ラ ッ ト 1 匹当 り 1 0 0 ^ 1 (結合体 と して 1 mg/匹） を大腿部皮下に投与 した。 投与後 2 4 時間でラ ッ トをェ一テル麻酔下心臓採血 して致死さ せ、 直ちに肝臓、 腸管膜 リ ン パ節、 腰椎 リ ン パ節および鼠径 部 リ ンバ節を摘出 し、 組織湿重量を測定 した。
    [0208] 摘出 した各組織は、 1 0 mMリ ン酸緩衝液一 1 . 1 5 % K C 1 ( p H 7 . 8 ) を加えてホモ ジネ イ ト した。 血漿 はそのま ま 、 各組織はホモ ジネィ 卜 に終濃度 0 . 2 %と な る よ う にプロテア一ゼ （プロナ一ゼ） を加え、 3 7 °C で一晚反応させてタ ンパク質を消化分解 した。 続いて終 濃度 0 . 2 %にセチル ビ リ ジニゥ ム ク ロ ラ イ ドを加えて ヒ アル ロ ン酸ーェ ピル ビ シ ン結合体を沈殿さ せた。 沈殿 は 0 . 5 M— N a C 1 で抽出 した。
    [0209] ヒ ア ルロ ン酸ー ェ ビル ビ シ ン結合体の濃度は、 励起波 長 4 7 0 nm、 蛍光波長 5 8 5 nm ( p H 4 . 6 ) で測定 し た。
    [0210] 第 2 0 図にェ ピル ビ シ ンの検量線を示すが、 約 1 0 ~ 3 0 0 ng/m lの範囲で良好な直線性を示 した。
    [0211] 第 1 9 図に血漿、 肝臓、 腸管膜 リ ン パ節、 腰椎 リ ンパ 節およ び鼠径部 リ ンパ節の ヒ ア ル ロ ン酸ー ェ ピル ビ シ ン 結合体の濃度結果を示す。
    [0212] 所属 リ ンパ節であ る腰椎および鼠怪部 リ ンパ節に極め て高い指向性が観察され、 血漿中濃度のそれぞれ約 3 5 倍および 4 5 倍であ っ た。 ヒ アルロ ン酸の代謝組織と し て知 られる肝臓と比較 して も 5 〜 7 倍の高濃度であ っ た。 炭素粒子 （墨汁） は リ ンパ節に移行するが、 リ ンパ節 では代謝さ れない こ と か ら リ ンパ節に蓄積する。 し か し、 ヒ ア ル ロ ン酸ーェ ビル ビシ ン結合体 （赤色を示す） は リ ンパ節に蓄積する こ と な く 、 リ ンパ節で代謝されている 現象が確認された。
    [0213] 以上説明 したよ う に ヒ アル ロ ン酸ー ェ ピル ビシ ン結合 体は、 作用部位と な る所属 リ ンパ節であ る腰椎および鼠 径部 リ ンパ節に、 血漿と比較 して約 5 0 倍の高い指向性 を有する こ とが認め られた。 実施例 5 ヒ アル ロ ン酸一サイ ト シ ンァ ラ ビノ シ ド結合 物質
    [0214] 製造例 1
    [0215] ァセチル化 ヒ アルロ ン酸 1 g を、 脱水 した 1 0 0 m lジ メ チルホルムア ミ ドに 1 % ( W/V) の濃度に溶解する。 約一 1 0 °C に冷却後、 液を攪拌さ せなが ら、 1 m lの ク ロ 口蟻酸イ ソ ブチルおよび ト リ ェチルア ミ ンを こ の順番に ゆつ く り 滴下する。 攪拌を更に 1 時間続け、 ァセチル化 ヒ アルロ ン酸のカ ルボキ シ菽を活性型に変換する。
    [0216] 3 0 0 mgのサイ ト シ ンァ ラ ピノ シ ドを シ メ チルホルム ァ シ ド 1 0 m lに溶解する 。 溶解後 1 m lの ト リ エチルァ ミ ンを加え、 0 °Cに冷却する。 こ の ものをァセチル化 ヒ ア ル ロ ン酸溶液に徐々 に滴下する。 ゆ っ く り 全体を攪拌さ せなが ら、 0 てで一晩反応さ せる。
    [0217] 反応終了後、 予め氷冷 し た 3 0 0 m lの褚製水に投入 し、 反応を停止させる。 沈殿 したァセチル化 ヒ ア ル ロ ン酸一 サイ ト シ ンァラ ビノ シ ドを遠心操作によ り 分離する。 沈 澱は精製水で 5 回遠心操作 し、 未反応のサイ ト シ ン ァ ラ ピノ シ ドを除去する。
    [0218] 最終沈澱は真空乾燥器で減圧乾燥させる こ と によ り 、 ァセチル化 ヒ アルロ ン酸一サイ ト シ ンァ ラ ピノ シ ドの純 品を得る こ とがで き る。 本品は、 白色の繊維状を呈する。
    [0219] 本品を、 3 0 〜 5 0 % の プ ロ ピ レ ンダ リ コ ー ルを含む 注射用蒸留水に溶解させ、 0 . 2 2 μ mの メ ンブラ ンフ ィ ルタ ーで濾過する こ と によ り 無菌の注射剤とする こ と ができ る。
    [0220] ま た本品は、 1 0 〜 2 0 %のプロ ピ レ ング リ コ ー ノレま たはエタ ノ ールを含む注射用生理食塩液に溶解さ せる こ とがで き、 ゲル状を呈 して懸濁 し、 有効な癌栓塞療法剤 とする こ とができ る。
    [0221] 製造例 2
    [0222] 更に、 ァセチル化 ヒ ア ルロ ン酸一サイ ト シ ンァ ラ ビノ シ ド結合物質は、 以下のよ う にアルカ リ 処理する こ と に よ り 、 ヒ ア ル ロ ン酸 一 サ イ ト シ ン ァ ラ ピ ノ シ ド結合物質 にする こ とができ る。
    [0223] ァ セ チ ル化 ヒ ア ノレ ロ ン酸 一 サ イ ト シ ン ァ ラ ピ ノ シ ド結 合物質 5 0 0 mgを 5 0 m lの精製水に懸濁 さ せる。 抨 し ながら終濃度 0 . 1 N にな る よ う に 5 N — N a 0 II を滴 下する。 室温で 3 時間攪拌を続け る こ と によ り 0 — ァセ チル基が除去され、 沈澱は溶解する。 そ して、 5 M酢酸 を加え、 中和する。
    [0224] 3 倍容量のアセ ト ンを加え、 生成 し た ヒ ア ル ロ ン酸一 サイ ト シ ン ァ ラ ビノ シ ド結合物質を沈殿させる。 沈殿は 遠心操作によ り 回収する。
    [0225] 沈殿は 5 0 m lの 1 0 0 mM酢酸ナ ト ウ リ ム緩街液に溶解 さ せる 。 3 倍容量のアセ ト ンを加え、 ヒ ア ル ロ ン酸ーサ ィ ト シ ンァ ラ ビノ シ ド結合物質を沈殿さ せ、 遠心操作に よ り 回収する。 以上のアセ ト ン沈殿操作を 3 回繰返すこ と によ り 、 純粋な ヒ ア ルロ ン酸一サイ 卜 シ ン ァ ラ ビノ シ ド結合物質を得る。 最終沈殿を、 室温で真空乾燥器によ り 乾燥さ せる こ と によ り 、 4 1 5 mgの白色粉末を得る。 粉末は製造例 1 と同様に処理する こ と に よ り 、 無菌の 注射剤とする こ とができ る。
    [0226] ま た、 本実施例にでは、 サ イ ト シ ン ァ ラ ビノ シ ド結合 量 （重量％ ) は、 遊離サイ ト シ ン ァ ラ ビノ シ ドおよ び結 合体の 2 7 2 nmにおけ る吸光度か ら算出 して、 1 6 . 4 3 %であ っ た。 ま た、 分子量は極限粘度法によ り 求めた と こ ろ、 8 6 . 8 kdであ っ た。
    [0227] 以上の よ う に製造 し た ヒ ア ルロ ン酸一 サイ ト シ ン ァ ラ ピノ シ ド結合物質は、 下記の性質を有する。
    [0228] ①分子量 ： 1 0 〜 ： 1 0 ， 0 0 0 k d
    [0229] ②抗癌剤 （サイ ト シ ン ァ ラ ビノ シ ド） の結合量 ： 0 . 1 〜 4 5 重量％
    [0230] ③性状 ： 0 . 5 % ( W/V) 水溶液ま たは水系溶液あ るい は懸濁液にて無色透明 · 無臭。 ④溶解性 ： 水、 生理食塩液、 等張化 リ ン酸緩衝液 リ ン酸 緩衝液に可溶、 メ タ ノ ール、 アセ ト ン、 エーテル、 ク ロ 口 ホルム に不溶。
    [0231] ァセチル化 ヒ アルロ ン酸一サイ ト シ ンァラ ピノ シ ドは、 プロ ピ レ ン グ リ コ ーノレない し エ タ ノ ールを 3 0〜 5 0 % 含む水溶液に可溶。 同 じ溶媒を 1 0〜 2 0 %含む水溶液 にゲル状に懸濁する。 ジメ チルホルムア ミ ド、 ジメ チル ス ルホキ シ ド、 エチ レ ン グ リ コ ー ル、 プ ロ ピ レ ン グ リ コ ールに可溶。 水、 アセ ト ン、 エーテル、 へキサ ンに不溶。
    [0232] ⑤呈色反応 ： 力ルバゾ―ル · 硫酸反応、 酸加水分解後ェ ノレ ソ ン · モルガ ン反応に陽性。
    [0233] ⑥紫外部吸収 ： 2 4 7 nm、 3 0 5 nmに紫外部吸収の ピ一 ク を有する （第 2 2 図） 。
    [0234] ⑦抗癌剤の遊離 ： 生体内での ヒ アルロ ン酸の代謝分解に 伴ってサイ ト シ ンァラ ビノ シ ドが遊離さ れる。
    [0235] ⑧セフ ァ ク リ ル S — 2 0 0 を支持体とするゲル濾過カ ラ ムに添加後、 力 ルバソ ール · 硫酸反応を行う と分子量約 9 0 k dの位置に結合物質の ピー ク が観察される。 ま た、 同 じ位置にサイ ト シ ンァラ ビノ シ ドに起因する紫外部吸 収が観察される （第 2 3 図） 。
    [0236] 以上説明 したよ う に本発明にかかる ヒ ァ ルロ ン酸ー薬 効成分結合物質によれば、 特定組織への強い指向性を有 し、 他の組織への副作用を効率的に抑制 しつつ、 薬効を 充分に発揮させる こ とができ る。
    权利要求:
    Claims 請 求 の 範 囲
    ( 1 ) ヒ アルロ ン酸と薬効成分を共有結合さ せた こ とを 特徴とする ヒ アルロ ン酸ー薬効成分結合物質。
    ( 2 ) 請求項 1 記載の物質において、 ヒ アル ロ ン酸のグ ルク ロ ン酸残基のカ ルボキ シル基に薬効成分がア ミ ド結 合されてい る こ と を特徴とする ヒ アルロ ン酸ー薬効成分 結合物質。
    ( 3 ) 請求項 2記載の物質において、 薬効成分は抗癌剤 であ る こ と を特徴とする癌の リ ンパ節転移抑制剤。
    ( 4 ) 請求項 2 記載の物質において、 薬効成分は抗癌剤 であ る こ と を特徴とする非特異的癌 ミ サィ ル療法剤。
    ( 5 ) 請求項 3 記載の物質において、 ヒ アル ロ ン酸はァ セチル化 ヒ アルロ ン酸であ る こ と を特徴とする癌の リ ン パ節転移抑制剤。
    ( 6 ) 請求項 4 記載の物質において、 ヒ アル ロ ン酸はァ セチル化 ヒ アル口 ン酸であ る こ とを特徴とす る非特異的 癌 ミ サイ ル療法剤。
    ( 7 ) ヒ アルロ ン酸ナ ト リ ウ ム水溶液に ピ リ ジ ン及び 塩酸を加え攪拌後、 1 一ェチル— 3 — （ 3 — ジメ チルァ ミ ノ プロ ビル） カ ルポジイ ミ ド （ E D C ) 及び N — ヒ ド ロ キ シ こ は く 酸ィ ミ ドを加え反応さ せる ヒ ア ルロ ン酸活 性化工程と 、
    活性化 ヒ アルロ ン酸を リ ン酸緩衝液に溶解させ、 薬効 成分水溶液を加え反応させる結合工程と 、
    を含むこ と を特徴とする ヒ ア ルロ ン酸ー薬効成分結合物 質の製造方法。
    ( 8 ) 請求項 7 記載の製造方法において、 ヒ アル ロ ン酸 と してァセチル化 ヒアルロ ン酸を用い、 有機溶媒系で薬 効成分と反応させる こ とを特徴とするァセチル化 ヒ アル 口 ン酸ー薬効成分結合物質の製造方法。
    ( 9 ) 請求項 7 記載の製造方法において、 ヒ アル ロ ン酸 と してァセチル化 ヒ アル ロ ン酸を用い、 有機溶媒系で薬 剤と結合反応させ、 その後、 ァセチル基を除去する こ と を特徴とする ヒ アルロ ン酸ー薬効成分結合物質の製造方 法
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    DE10151158B4|2001-10-19|2004-07-29|Esplora GmbH c/o TU Darmstadt Institut für Biochemie|Verbindungen zur Markierung von Zellmembranproteinen|
    法律状态:
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    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP2/280628||1990-10-18||
    JP28062890||1990-10-18||
    JP3/159611||1991-06-03||
    JP15961191||1991-06-03||DE69125595T| DE69125595T2|1990-10-18|1991-10-18|Kombination von hyaluronsäure mit einem medizinischen bestandteil, und seine herstellung|
    CA002070672A| CA2070672C|1990-10-18|1991-10-18|Compound of medicinal ingredient and hyaluronic acid and process for producing the same|
    EP91917837A| EP0506976B1|1990-10-18|1991-10-18|Combination of hyaluronic acid with medicinal ingredient and production thereof|
    AU87140/91A| AU652784B2|1990-10-18|1991-10-18|Combination of hyaluronic acid with medicinal ingredient and production thereof|
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